大小鼠脑注射（病毒、细胞注射......）

2020-10-18 21:22:37

以小鼠为例，

一、技术原理

主要采用脑立体定位技术，它利用动物大脑结构和颅骨表面标志（如前囟、后囟、矢状缝、外耳道、门齿位等）来确定大脑皮层下功能性脑区的X/Y/Z三维坐标位置，以便在非直视暴露的条件下植入微电极、注射针、光纤，进一步对其进行定向的刺激、损毁、药物注射、电信号记录等研究，是脑科学研究领域常用的重要研究手段。常用的实验动物，如大鼠、小鼠、豚鼠、猫、鸟类等，均有上述结构和（或）定位标志，在进行大脑固定后，即可根据脑立体定位图谱或某些参考文献所提供的数据确定目标脑区，进行定位、注射等操作。

二、实验材料

1、脑立体定位图谱

2、仪器设备、耗材

3、实验动物

C57成年小鼠，4-6周龄，20-30g。

三、实验步骤

1、动物麻醉
采用异氟烷气体麻醉，将小鼠放入预麻箱，调节高气流量和麻醉浓度（约4LPM, 5%），小鼠1分钟内进入深麻状态（通过观察动物活动状态、呼吸、倾斜预麻箱等方法判断），取出小鼠，放置于定位仪设备，进行头部固定；

2、头部固定
选择带有定位仪专用气体麻醉面罩的小鼠适配器，将小鼠的门齿扣置于适配器（此时老鼠置于麻醉面罩的腔内，维持麻醉），轻压鼻梁，前后移动适配器，使左右两侧耳杆中心线与小鼠外耳道位于同一直线上，然后将左、右耳杆分别推入外耳道，调节两耳杆位置中心对称、且高度一致，螺丝锁紧固定耳杆。进一步地，上下调整适配器门齿扣位置，使其位置低于左右耳杆中心连线3.3±0.4mm，前后再次微调门齿扣、鼻梁与耳杆之间的位置，压紧鼻梁，此时头部已固定，颅骨水平位基本调平（注意：这个是初步判断标准，还需进一步判断）、且鼻嘴处于适配器的麻醉面罩里、呼吸来自麻醉机的气体维持麻醉（此时调节气流量约1LPM，浓度约1%，可通过观察动物呼吸、夹捏尾巴等方法判断）。
检查头部是否固定成功：鼻对正中，提尾不掉，目测大脑水平，从上、左、右、侧各个方向推压动物头部均不动。

3、备皮
备皮前，于眼部涂眼膏。
用剃毛器剔除头部毛发，碘伏和酒精棉球消毒，沿矢状缝作一1cm长的皮肤切口，分离皮下组织，去除颅骨表面的筋膜及肌肉，推开骨膜，生理盐水和棉球清洁，可清晰暴露前囟、人字缝及矢状缝。

4、零点定位
定位仪夹持一金属定位针，将金属定位针移动到矢状缝上方后，再前后移动定位针，使定位针刚好接触定位到前囟点（Bregma），此步需借助带LED灯的视频显微镜放大判断，提高定位准确性。

5、颅面二次调平
将定位针从前囟点开始，第1步，沿矢状线向后移动到约2.5mm位置、左右各2mm位置，观察在矢状线上，定位针在前囟点和2.5mm位置点距颅面是否高度一致，以及在左右2mm位置点，定位针距颅面是否高度一致；第2步，继续矢状线向后移动到约4.2mm位置，观察在矢状线上，定位针在前囟点和4.2mm位置点距颅面是否高度也一致。这两步判断，若不一致，需微调左右耳杆高度位置、门齿鼻梁处高度位置；
通过这个调节，颅面即可确定调平，读数允许误差±0.03mm。

6、目标脑区定位
首先，从脑立体定位图谱或文献确定目标脑区（纹状体）的三维坐标，选取合适坐标点（AP+0.98mm,ML+2.0或者-2.0mm,DV-3.0mm），如下图：

从前囟点开始移动定位针，在前囟前0.98mm, 矢状缝左或右旁开2.0mm处定位一点，用记号笔做好标记，即为纹状体在X-Y平面的位置；

7、钻孔
选取合适大小钻头，比注射针稍大一点即可，手持颅钻，或者将颅钻夹持固定于定位仪上，在标记点处钻孔。注意：掌握手感，切忌大力，钻孔突破时，有明显的落空感，此时后退颅钻，如果再继续钻孔，会进入脑组织，造成损失。另外，建议钻头蘸取生理盐水或PBS进行降温。
钻孔后，用医用注射器的细针头小心挑破硬脑膜，防止损伤，如果在此过程中有出血，可以用很小的医药棉球拉成长条形将血吸走。

8、夹持注射针
抽取药物于注射器，夹持于定位仪上，将注射器针头定位于前囟点处，然后按坐标移动到钻孔窗口，继续往下缓慢植入注射针。设置好注射参数（注射器规格【容量、活塞内径】、目标注射体积、注射速率），即可开始注射（参考：纹状体注射1ul,速率约0.5ul/min；病毒注射1ul，速率约0.2ul/min）。
注射完毕，停针5-10min，使药物充分扩散吸收，再缓慢退针。
注意：如果是病毒、细胞注射，选择玻璃电极注射；如果是大容量注射，选择汉密尔顿注射器注射。

9、动物复苏
缝合伤口，碘伏消毒，然后将小鼠从定位仪上取下，放置于饲养笼内。由于采用的是气体麻醉，所以动物苏醒很快，约2分钟。

10、定位点准确性验证
在开展正式药物注射前，需做预实验验证目标脑区定位的准确性。推荐使用示踪Dil染料（1周后取材检测）、荧光金染料（2周后取材检测）或者红色、黑色染料（1周后取材检测），然后取材做冰冻切片，对照脑图谱的一些参照物来判断脑区定位是否准确（可以选择较大、清晰的参照物，比如海马、侧脑室、视交叉核团等）。
注意：切片从外向目标核团靠近且，注意大脑切片角度与脑图谱保持一致。

全套配置清单：

序号	货号	型号	名称	规格	单位	数量
1	10-0030	Nova1000	小动物麻醉机	移动型、异氟烷罐、POUR FILL、CAGE MOUNT。一体化集成功能配置：移动支架、内置气源泵、抽气泵、废气吸收罐、大小鼠预麻箱、抽屉箱、置物篮及管路	台	1.00
2	10-2203		小鼠定位仪专用面罩-G2		个	1.00
3	30-1130	SM100D	脑立体定位仪	小鼠、单臂、数显	套	1.00
4	20-0190	i-Star300	编程式纳升注射泵	毛细玻璃电极注射	套	1.00
5	19-7010	FASTRONG	颅钻	0-35000RPM顺逆转，脚踏和手控	套	1.00
6	33-0002	PC-100	拉制仪		台	1.00
7	33-3003	GN7000	磨针仪		台	1.00
8	16-0050	FOI304	LED冷光源	色温6000K，35W光强可调	套	1.00
9	16-0020	SM200B	体视显微镜	摇臂式双目	套	1.00
10	18-8010		大脑手术器械包	13件套	套	1.00
11	18-8090		动物手术消毒套装	7件套	套	1.00
12	19-7001		小动物剃毛器		套	1.00
13	19-7223		红霉素眼膏	0.5%*2G（5支/包）	包	1.00